象耳豆根结线虫两个新的基因（MeActin和MeHsp70）的克隆与特性研究　　根结线虫（Meloidogynespp.）为植物根系内寄生物，可对农作物导致相当严重的危害。在国内大约30多种根结线虫中，象耳豆根结线虫（M.enterolobiiYangandEisenback,1983）在海南岛已广泛产于，广东省也有找到。通过海南岛茄果类蔬菜根结线虫种类检验，找到该种群已更进一步蔓延，正在表明出有代替南方根结线虫M.incognita，而沦为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。

近年来对该线虫的研究倍受注目，但对于其功能基因及功能基因组等分子生物学研究报导很少。本研究以该线虫为材料，使用RT-PCR、cDNA末端较慢扩充法（RACE），克隆获得M.enterolobii的Actin基因和Hsp70基因的全长cDNA序列，并对它们展开了生物信息学分析以及MeHsp70原核传达分析。主要研究结果如下：（1）MeActin基因全长cDNA序列为1298bp，包括一个全长1125bp的对外开放读者框ORF，编码375个氨基酸，接续密码子在82位，中止密码子在1207位（GenBank登录号KF534787），与未知的其它物种的Actin具备高度的保守性，与马铃薯枯萎茎线虫D.destructorto和松才线虫B.xylophilusActin的同源性分别为99.20%和98.67%，与秀美隐杆线虫C.elegans、人类H.sapiens相似性分别超过98.67%和97.33%。

系统发育分析表明，MeActin有可能是β-Actin，同时也找到了MeActin与人类的胞质Actin（β-Actin）更加相近。MeActin基因的分离出来为M.enterolobii其它基因的传达和调控研究获取了内参基因。（2）MeHsp70基因全长cDNA序列为2203bp，所含1959bp的对外开放读者板，编码653个氨基酸，比较分子量为71.09kDa，具备3段Hsp70家族的亲笔签名序列，GenBank登录号KF739434。同源性分析表明，氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具备很高的相似性。

该Hsp70与其他物种中的Hsp70展开系统演化分析，结果显示，Hsp70的系统发育树根无法反映物种间的亲缘关系，推断其体现的是有所不同物种间Hsp70生物学功能的相似性程度。生物信息学分析表明，MeHsp70基因所编码的蛋白质以亲水性区域居多，无信号肽，无横跨膜区域，为非黏液型蛋白，该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规卷曲居多，同时MeHsp70还不存在卷曲螺旋结构。建构了pEASY-E1-MeHsp70和pET30a-MeHsp70原核传达载体，当IPTG惜浓度为0.4-1.0mmol/L时，能诱导传达MeHsp70。

从原核生物角度分析MeHsp70的特性，找到传达MeHsp70的原核细胞显著比对照耐受性高温威逼。MeHsp70基因的克隆和传达，将为M.enterolobii的生态适应性机理研究获取依据。

关键词：象耳豆根结线虫；MeActin;MeHsp70；克隆；传达1象耳豆根结线虫研究进展M.enterolobii最先于1983年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上找到并检验和命名［1］，后经徐建华等证明国外学者普遍报导的玛雅根结线虫M.mayaguensis为M.enterolobii的新种［2］。M.enterolobii在全球农作物中早已沦为一种经济上最重要的宿主线虫[3-4]。近年来，M.enterolobii的很快传播也引发了学者的普遍注目。

2008年，欧洲首次报导M.enterolobii，同年，欧洲植物保护的组织（EPPO）报导中国出口欧洲的玫瑰花上求救到该线虫，EPPO对该线虫展开风险评估，指出对中欧地区作物不存在较小威胁［5］。在国内，M.enterolobii近年来也相继被报导，目前在海南岛已广泛产于，广东省也有找到［6］。调查结果，在海南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药作物和热带果树皆已找到有M.enterolobii普遍宿主[7]，同时M.enterolobii还可宿主装载Mi抗性基因的番茄和辣椒[8]。

通过海南岛茄果类蔬菜根结线虫种类检验[9]，找到M.enterolobii种群已更进一步蔓延，正在表明出有代替南方根结线虫，而沦为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。随着我国现代农业和设施农业的发展，温室和设施大棚大大减少而造成土壤温度的下降，使得M.enterolobii侵略内陆地区沦为有可能，这将给全国的农作物生产带给威胁。

近年来对M.enterolobii的研究倍受注目，但对于其功能基因及功能基因组等分子生物学研究报导很少。2肌动蛋白概述在真核细胞中，肌动蛋白（Actin）是一种最重要的膨胀蛋白。Actin是引发肌肉膨胀的主要成分之一，在非肌肉组织中，Actin是细胞骨架的最重要组成部分，参予许多过程，如细胞运动，内吞起到，胞外分泌，吞噬作用，细胞器运动，蛋白运输和信号转导［10-13］。Actin是高度激进的蛋白质，还包括哺乳动物和线虫。

它被普遍用于分子标尺，预测物种之间的进化距离，评估种群变化［14-15］。在脊椎动物中，Actin蛋白有3类亚型：α、β和γ。

其中α-Actin蛋白不存在于肌肉组织中，β-Actin和γ-Actin蛋白是不存在于胞质中。近来早已从众多的物种中克隆到Actin，例如，人类［16］、鼠［17］、果蝇Drosophila［18］、B.xylophilus［19］。

众所周知，要深入研究M.enterolobii其它功能基因，内标参考是必不可少的。使用RACE-PCR技术顺利克隆了M.enterolobii肌动蛋白基因Actin的全长cDNA序列，为更进一步积极开展研究其功能基因的传达和调控奠下基础。

3植物宿主线虫Hsp70研究进展热激蛋白（Heatshockproteins,Hsps）于1962年由遗传学家Ritossa在研究果蝇唾液腺时被找到，继而沦为众多学者研究植物抗逆性机制的热点。热激蛋白家族中以Hsp70的含量最非常丰富、结构和功能尤为激进，且当作分子伴侣，高温、旱季、低温以及重金属离子等各威逼因子均可诱导其制备减少[20]，因而沦为Hsps家族中最不受注目的对象。3.1Hsp70家族的分类Hsp70是一组在演化上高度激进的焦虑蛋白，还包括21种蛋白质。根据人们对Hsp70的区分标准的有所不同，其分类也不完全相同。

Hsp70可分成4种亚族成员：1）热激同源蛋白70（即Heatshockcognate70,或Hsc70），其在所有生物体细胞基质内均可传达，但一般来说情况下的传达水平较低，且容易加热诱导，归属于构成型Hsp70，与其它Hsp70亚族蛋白的生化特性相近，序列同源性达95%以上[21]；2）Hsp70，又称Hsp72，一般情况下以低水平传达，但在焦虑条件下其传达水平极高，是诱导型的Hsp70，具备全或无的特点[22]；3）葡萄糖调节蛋白75（Glucoseregulatedprotein7,Grp75），主要坐落于线粒体内；4）葡萄糖调节蛋白78（Glucoseregulatedprotein78,Grp78），主要坐落于内质网腔内。Grp75和Grp78在焦虑条件下的传达量很低，但是在细胞内它们皆起着分子伴侣起到。Hsc70、Grp75和Grp78在无威逼情况下皆能传达，而Hsp70仅有在焦虑条件下才诱导产生。

3.2Hsp70的结构及其生物学功能Hsp70蛋白由三部分构成，即高度激进的氨基末端ATP酶区、比较激进的底物识别区和羧基端星型区。Hsp70的ATP酶活性区是坐落于Hsp70蛋白的氨基末端大约400个氨基酸残基，比羧基端部分具备更高的保守性，与有所不同生物Hsp70所共计的生化特性有关；Hsp70蛋白的底物识别区是羧基端大约180个氨基酸残基[23]，能与主要的组织相容性复合物抗原融合[24]；羧基端星型区结构尚能不具体，有可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关[25]。

　　Hsp70在细胞内当作分子伴侣的角色，是众多学者尤为注目和积极开展深度研究的一类热激蛋白[26]，它普遍产于于所有原核生物和真核生物的细胞内，普遍参予细胞的各种生理活动，归属于非特异性的细胞保护蛋白的一种，对保持肽链准确拉链与弯曲和调节蛋白内环境平稳具备十分最重要的起到。　　Hsp70可通过焦虑传达产生新的免疫系统物质来包覆细胞和外来抗原而维护细胞[27]，Hsp70低传达可以显著地诱导JNK的产生，从而切断JNK细胞内的细胞细胞死亡[28]。Hsp通过C末端与肽复合物融合而充分发挥着肿瘤免疫原性起到[29]，它不仅需要增进CTL细胞内的肿瘤细胞细胞死亡[30]，而且还能作为免疫系统显性抗原诱导宿主产生细胞毒T淋巴细胞[31]。

Hsp70与细胞的细胞分裂不存在一定关系，当细胞从分化期G0转入G1的同时不会产生Hsp70[32]。Hsp70还具备对细胞周期长短展开掌控的基本功能[33]，从而起着维护细胞的起到。

在高温、低温、旱季等非生物因素威逼下，Hsp70还需要对生物耐受性加以调节的。王枫等通过硫酸镉诱导K562细胞的Hsp70低传达，并利用RT-PCR对Hsp70的mRNA水平展开检测，结果是细胞起到1h后Hsp70的mRNA水平明显下降，且Hsp70的mRNA水平与细胞耐高温能力成正涉及[34]。同时，Hsp与耐热冷性的必要关系已被Collins等[35]证实。

　　Hsp70的N末端具备ATPase功能，不仅可以调节ATP的供能系统和水解ATP，多肽或蛋白质可通过能量的获释击穿内质网或线粒体膜，还能对Hsp70与多肽复合物的融合和获释展开有效地掌控[36]。长时间情况下线粒体中Hsp70还可以转入线粒体腔的前导肽交联，直接参与蛋白质运输[37]。

Hsp70正是通过其ATPase的起到来行使其分子伴侣的功能[38]。3.3植物宿主线虫Hsp70的研究　　　目前，国外已从旋尾目、杆形目和夹刃目线虫中克隆出有多个Hsp70基因，并且在马来布鲁丝虫B.malayi[39]、P.trichosuri[40]和捻转血矛线虫H.contortus[41]Hsp70基因转至模式生物实验中，分析其启动子活性和焦虑条件下传达量的变化。演化过程中Hsp70的保守性对生物体的生命活动至关重要，如C.elegansHsp-1基因绝望将造成其母体不孕和胚胎丧命等不良现象[42-43]。基于Hsp70的保守性，它可作为分析自然界的生物进化的有效地依据，例如通过建构和分析植物宿主线虫Hsp70的系统发育树根，就能更佳地阐述植物病原线虫种类之间的演化和系统发育关系。

在我国广大的热带亚热带地区，植物宿主线虫世代重合显著，为患相当严重，不免不存在农药欺诈，这些环境因素可诱导植物宿主线虫Hsp70大量产生，所以研究Hsp70家族的结构和功能将有助更进一步说明了植物宿主线虫对环境适应性的分子机理及其外用威逼外用逆境的机制，将为植物线虫病害的预防获取不利的证据。3.4未来发展　　植物宿主线虫侵略寄主植物过程中造成宿主长时间生长阻碍而诱导宿主产生Hsp70，从而超过寄主植物的自身维护，同时线虫受到环境温度和化学系因素威逼也不会产生Hsp70而使线虫最后躲避宿主抗性。这指出了Hsp70在线虫与宿主互作中均具备最重要起到，也为研究它们的互不作机制获取一定的理论基础。

Hsp70也未来将会沦为生物体遭到威逼剧毒物质检测的一种命令蛋白，对于环境质量的检测和评估近于有可能是一个最重要参数。　　植物宿主线虫对高温及其它逆境因素威逼的号召是一个多因子掌控的简单过程，对其抗逆威逼如耐热性研究无法全然寄希望于某种蛋白或某个基因的特性和功能分析，不应融合其它涉及研究综合地展开探究，全面了解和解析植物宿主线虫的抗逆生理。况且，植物宿主线虫Hsp70基因的传达与调控机制仍未获得普遍而深入研究。　　Hsp70是一类与生物抗逆性涉及的热激蛋白，且与生物有机体的生长和发育高度涉及。

植物宿主线虫由于应激反应而产生Hsp70是其整个生活史的一部分，归属于一种生理现象。鉴于Hsp70具备分子伴侣活性、细胞保护、免疫系统等多种最重要的生物学功能，因此有不少学者已克隆并取得了有所不同生物体Hsp70家族成员的同源基因，从而使其沦为近年来研究的一个焦点。对模式生物Drosophila和C.elegans的Hsp70生物学功能研究已十分了解。

目前也已从植物宿主线虫D.destructor、H.glycines、B.xylophilus和B.mucronatus中克隆出有Hsp70基因。而作为当前生产上危害相当严重的最重要植物宿主线虫，Meloidogyne的Hsp70研究目前却还正处于空白。

此外，植物宿主线虫发育与抗逆过程的Hsp70生物学功能仍未见报导。　　最近研究结果显示Hsps具备“变异缓冲器”的功能，与Zhu[44]明确提出的“进化能力分级制约假说”统合了分子和发育遗传学成果的内涵，不利于外延现代演化理论，使Hsp70有可能沦为物种演化研究新的工具。

　　基于Hsp70基因生物学功能的高度保守性，植物宿主线虫中的Hsp70可作为伴侣分子参予线虫体内蛋白质降解、蛋白质准确拉链和蛋白质间相互作用。虽然现阶段嗣后无法对植物宿主线虫展开基因改建，研究也仅限于蛋白质水平，但随着分子生物学与蛋白质组学技术的大大发展和成熟期，特别是在是通过RNAi技术对植物宿主线虫Hsp70基因展开绝望，同时分析植物宿主线虫的发育、抗逆性和宿主能力，将为积极开展植物宿主线虫Hsp70生物学功能及其传达调控机制研究获取有效地的技术手段。随着生物体中Hsp70生物学功能和起到机理研究的不断深入，植物宿主线虫生长发育中更加多的Hsp70基因将不会被找到并加以调控，从而为植物线虫病害掌控获取新的途径。

4研究目的与意义M.enterolobii作为我国乃至世界热带和亚热带地区最不具威胁的根结线虫种类。线虫在侵略宿主的过程中，由于逆境转变了线虫的生理和免疫系统因素，造成虫体正处于应激状态，产生线虫的Hsp70，参予线虫分化，强化线虫毒力，躲避宿主的抗性起到。因此，Hsp70是研究线虫与逆境关系的一个很好的参数。本实验利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）融合cDNA末端较慢扩充（RACE）技术，通过对M.enterolobiiHsp70基因全长克隆及其序列分析，并建构了原核传达载体，将为M.enterolobii的抗逆性及其生态适应性的研究打下基础，对于今后积极开展该线虫的预防工作将有最重要意义。

　　　要深入研究M.enterolobii其它功能基因，内标参考是必不可少的。使用RACE-PCR技术顺利克隆了M.enterolobii肌动蛋白基因Actin的全长cDNA序列，为更进一步积极开展研究其功能基因的传达和调控奠下基础。

下篇研究内容1材料与方法1.1供试线虫M.enterolobii完整种群源于海南省农业科学院植保所植物线虫留存圃。1.4象耳豆根结线虫种群的提纯与培育1.4.1象耳豆根结线虫的检验（1）在解剖学镜下，从培育M.enterolobii完整种群的番茄根结线虫上挑选色泽朱、大而圆润的优质单卵块，展开产卵。

萃取单条根结线虫二龄幼虫DNA展开检验。（2）在解剖学镜下，用制做的睫毛针将根结线虫二龄幼虫挑至含5μl消毒水的载破片中，用挑针将根结线虫二龄幼虫截成2-3节，含有物阻塞，用枪汲取，置放200μl的PCR管中，特消毒水补充至8μl，再行重新加入2μl的5×降解Buffer（10×PCRBuffer与1000μg/ml的蛋白酶K，按1:1的体积比混合）；（3）将PCR管移往到-70℃的冰箱中，冷藏30min；（4）将冷藏后的PCR管摆放到PCR仪中，65℃1h，95℃10min；（5）携带型离心机瞬时离心，上清液才可用作PCR扩充或摆放-20℃冰箱中可用。（6）参照TiganoSCAR引物[45]（MK7-F：5’-GATCAGAGGCGGGCGCATTGCGA-3’,MK7-R：5’-CGAACTCGCTCGAACTCGAC-3’），使用25ul反应体系，引物各1.0ul，2×TaqMasterMix（不含染料）12.5ul，模板DNA5ul，无菌水ddH2O4.5ul。

PCR反应参数为94℃实变性4min，94℃变性30s，55℃热处理30s，72℃伸延1min，反应共30个循环，72℃伸延10min。（7）所取5ulPCR产物于浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上检测所扩充片段的大小，在凝胶光学系统摄影和留存。1.4.2象耳豆根结线虫的培育将检验为M.enterolobii的二龄幼虫疫苗到预先培育在消毒土壤、宽有4-5片真叶的番茄稚嫩根尖部，在大棚中培育大约42-56d，视墒情必要施肥，留意维持土壤湿度，施肥时避免线虫被水冲淋到土壤下层，间隔20-30d施复合肥一次。

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